Yazdır

İnfeksiyon Hastalıklarının Epidemiyolojik Analizinde Kullanılan Moleküler Tiplendirme Yöntemleri

Ayşegül YAĞCI*

Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İSTANBUL

Molecular Typing Methods for Epidemiological Analysis of Infectious Diseases

Key Words: Molecular typing, Infection, Epidemiological analysis

Anahtar Kelimeler: Moleküler tiplendirme, İnfeksiyon, Epidemiyolojik analiz

İnfeksiyon hastalıklarının epidemiyolojisinde izole edilen mikroorganizmalar arasındaki ilişkinin gösterilmesi büyük önem taşır. Salgınların çoğu ortak bir etkene bağlı gerçekleşir, bu durumda bir klonun yani genetik olarak aynı ya da çok yakın bir organizmanın varlığından sözedilebilir. Farklı kaynak ve yerden izole edilen mikroorganizmalar arasındaki ilişkinin gösterilmesi, alt-tipleme (subtyping), salgınların tanımlanması, kaynağın belirlenmesi, immünizasyonla hedef patojenin eradikasyonu gibi amaçlara yöneliktir. Bu amaçla klasik olarak kullanılan biyotipleme, serotipleme, bakteriyofaj tipleme, bakteriyosin tipleme, antibiyogram gibi fenotipik belirteçler yerine 1980'lerin başından itibaren genotipik yöntemler kullanılmaya başlamıştır. Bu yöntemler;

1. Lipoprotein veya yağ asitlerine yönelik,

2. Proteinlere yönelik,

3. Nükleik asitlere yönelik yöntemler olarak gruplandırılabilir. Bu yazıda nükleik asitlere yönelik yöntemlerden bazıları hakkında bilgi verilecektir.

RESTRİKSİYON ENZİM ANALİZİ

Restriksiyon enzimleri (RE), çok özgül olarak DNA'yı belirli bölgelerden keserek genellikle 1000- 20 000 baz çiftlik fragmanlar oluşturan enzimlerdir. Sıklıkla kullanılan RE arasında EcoRI, ClaI, Hind III, Hinf I sayılabilir[1]. Agaroz jel elektroforezi sonrası etidyum bromid ile boyanan jelde oluşan fragmanların yeri ve sayısı kıyaslanarak elde edilen çeşitliliğe “Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)” adı verilir. Bu yöntemde en önemli basamak, DNA'nın hücre dışına çıkarılması ve saflaştırılmasıdır. Aksi halde enzimler DNA'yı kesemez ya da kısmen keser. DNA izolasyonuna gram-negatif bakterilerde önce lizozim, sonra triton-X100 gibi iyonik olmayan ya da SDS gibi iyonik bir deterjanla başlanabilirken, gram-pozitif bakterilerde lizostafin tercih edilir. Fenol-kloroform ekstraksiyonuyla bu çözeltiden protein ve lipidte çözünür materyaller uzaklaştırılır, sıvı fazdaki DNA etanol ya da izopropanol ile çökertilir, takiben %70'lik alkolle yıkanır ve çoğunlukla TE (10 mM TRIS-1mM EDTA) çözeltisi ile yeniden süspanse edilir. Protein, polisakkarit, fenol, kloroform, etanol, EDTA gibi kontaminantlar enzimin kesme gücünü düşürür. Bu durumda enzim ünitesini ya da inkübasyon süresini arttırmak düşünülebilir.

RFLP yöntemi kolaylıkla uygulanabilen duyarlı bir yöntemdir. Ancak enzim seçimi çok önemlidir ve çok sayıda ya da çok yakın bantları değerlendirmek mümkün olamamaktadır (Resim 1). Az sayıda mikroorganizmayla çalışıldığında değerlendirme nispeten kolay iken, sayı arttıkça kıyaslama güçleşmektedir. Bu zorlukları aşmak için kıyaslanan fragmanları azaltmak bir yöntem olabilir. Bu amaçla enzimlerle kesilen DNA fragmanları jelde yürütülür, takiben jelin üzerine aynı boyutta bir membran konulur, vakumla fragmanların membrana geçmesi sağlanır (blotting). Sonraki basamak hibridizasyon basamağıdır. Çift sarmallı DNA molekülünde her bir sarmal birbirini tamamlayıcı baz dizilerinden oluşur. Bu diziler bilindiği taktirde karşıtları sentetik olarak sentezlenebilir; tek sarmallı tamamlayıcı bu DNA ya da RNA dizisine “prob”, hedef DNA tek sarmalıyla prob DNA'sının tek sarmalının birleşmesine “hibridizasyon” adı verilir. Bu birleşmeyi görebilmek için probun radyoaktif maddeler (32P) ya da radyoaktif olmayan maddeler (biotin-digoksigenin) ile işaretlenmesi gerekmektedir. Sonuçta sadece probla hibridize olan fragmanlar görüleceğinden oluşan bant sayı ve özgüllüğü arttırılmış olur (Resim 2). Problar genel olarak şu şekilde sınıflandırılabilir:

a. “Randomly Cloned” (Rastgele Klonlanmış) Problar

Her bakteriyel tür için yeni bir set gerekmektedir ve kullanılabilir probların seçilmesi için çok sayıda prob denenmelidir.

b. Spesifik Virülans Faktörlerine Yönelik Problar

Virülans genlerine yönelik problar üniversal olarak uygulanamaz, her bakteri için özel olarak geliştirilmeli ve empirik olarak çeşitli nükleotid dizileri taranmalıdır. Örneğin, Pseudomonas aeruginosa'nın alginat ve elastaz kodlayan genleri çok korunmuş bir bölgede yer aldığından alt-tiplemede kullanılamazken ekzotoksin A'yı kodlayan gene yönelik prob kistik fibroz hastalarından izole edilen P. aeruginosa suşlarının alt-tiplendirilmesinde kullanılabilmektedir[2].

c. “Insertion Sequences (IS)” (Araya Giren Dizilimler)'e Yönelik Problar

IS'ler prokaryot ve ökaryotların çoğunda bulunan taşınabilir, tekrarlayan DNA elementleridir. Bakteri kromozom ve plazmidlerinde normalde bulunurlar, örneğin standart bir Escherichia coli'de < 10 IS kopyası bulunur. Bir IS elementi yer değiştirdiğinde konak DNA'da eksik kalan bölge iki katına çıkar: Direct repeats-direkt tekrarlayan bölgeler oluşur. Bu bölgelere yönelik probların kullanılması özellikle Mycobacterium tuberculosis'te denenmiş ve M. tuberculosis kompleksinin alt-tiplendirilmesinde başarılı sonuçlar alınmıştır[3,4]. Ancak üniversal kullanıma uygun bir yöntem değildir.

d. Ribozomal DNA RFLP Analizi (Ribotipleme)

16S ve 23S rRNA'yı kodlayan genleri kısmen ya da tamamen içeren genomik DNA restriksiyon fragmanlarının analizidir. rRNA'yı kodlayan genler çok korunmuş olduğundan tek bir probla tüm bakteriler alt-tiplendirilebilir, ayrıca bakterilerin çoğu çok sayıda ribozomal operon içerdiğinden elde edilen fragmanlar türler içi ve türler arası ayrıma yetecek sayıdadır. En sık kullanılan problardan biri E. coli 16S + 23S rRNA probudur. Problar radyometrik ya da enzimatik olarak işaretlenebilir; hibridizasyon matriksi olarak seçilebilen nitroselüloz membranlar radyoaktif işaretli problarla iyi çalışmakta ancak kolay yırtılabilmektedir, naylon filtreler daha dayanıklı olup enzim işaretli problarla çok iyi sonuçlar alınabilmektedir.

Ribotipleme stabilitesi ve iyi ayırtediciliği açısından avantajlı gibi görünmekle birlikte DNA izolasyonu, enzimlerle kesme, elektroforez, blotlama, hibridizasyon basamakları zaman alıcı ve oyalayıcıdır. Ayrıca her tür için uygun enzimler seçilmelidir ve 2 ya da 3 enzimin kullanılmasıyla ayırtedicilik arttırılmalıdır.

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR)

Kromozomal DNA'nın direkt olarak RE ile kesilmesi çok temiz ve fazla miktardaki DNA varlığında iyi sonuç vermekte, özgüllüğü ve değerlendirebilmeyi arttırmak amacıyla eklenen hibridizasyon basamağı gerekli zamanı uzatmaktadır. Bu nedenle örnekteki nükleik asitin amplifikasyonu yöntemi geliştirilmiş ve subtipleme daha kısa zamanda ve güvenilirlikte yapılabilir olmuştur. Bu amaçla kullanımda olan yöntemler şunlardır:

Loküs Spesifik Polimeraz Zincir

Reaksiyonu

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile özel bir genomik bölgeyi amplifiye etmek ve suşlar arasındaki çeşitliliği ya da antibiyotik direncini göstermek mümkün olabilmektedir. Virülans genlerine yönelik primerlerle Listeria monocytogenes'in farklı serotipleri, dış membran proteinini kodlayan genlere yönelik primerlerle Chlamydia trachomatis'in 18 serotipini tanımlamak mümkün olabilmiştir[5,6]. Kostman ve arkadaşları, 16S ve 23S rRNA'ya yönelik primerlerle, RE kullanmadan Pseudomonas cepacia izolatlarını birbirinden ayırtedebilmiştir[7].

Loküs spesifik PCR sonrası amplifikasyon ürününün RE ile kesilmesiyle yöntemin ayırtediciliği arttırılmaktadır. Helicobacter pylori suşlarında UreC genine yönelik primerlerle farklı hastalardan izole edilen suşlarda genetik çeşitlilik gösterilebilmiş, virülansla ilişkili loküslere (cag PaI, vacA) yönelik primerlerle tedaviye cevap vermeyen bireylerde tedavi öncesi ve sonrası suş kıyaslaması yapılabilmiş ve aile içi geçiş olup olmadığı saptanabilmiştir[8,9]. Bu yöntemle tür düzeyinde ayrım yapılabilmektedir; örneğin oküler infeksiyonlardan izole edilen Candida suşları (C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata, C. parapsilosis) ya da tüberküloz hastalarından izole edilen M. tuberculosis kompleksindeki M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum ve M. microti türleri isimlendirilebilmektedir[10,11]. PCR-RFLP ile antibiyotik direnç mekanizmalarını, örneğin Enterobacteriaceae türlerindeki farklı beta-laktamazları ya da M. tuberculosis suşlarında katG genindeki nokta mutasyonların saptanmasıyla farklı düzeylerde izoniyazid direncini saptamak mümkün olabilmektedir[12,13].

“Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)”

RE ile kesilen DNA fragmanlarının belirli bir bölümünün amplifikasyonuna yönelik bir yöntemdir. Bakteriyel DNA hücre dışına çıkarılıp saflaştırıldıktan sonra restriksiyon enzimiyle kesilir. Elde edilen çift sarmallı restriksiyon fragmanlarının her iki ucuna adaptör oligonükleotidler DNA ligaz ve ligaz tampon varlığında bağlanır. RE-ligasyon ile oluşan DNA amonyum asetat ile ve saf alkol ile çökertilir, %70'lik alkol ile yıkanır, distile suda süspanse edilerek PCR kalıbı olarak kullanılır, primerler adaptörlere komplementer oligonükleotid dizilerinden oluşur. Amplifiye ürünler agaroz jelde yürütülerek değerlendirilir. Kullanılan primerlerin 32P ile işaretlenmesi durumunda poliakrilamid jelde yürütülen bantlar röntgen filmine aktarılarak değerlendirilebilir ya da primerler floresan maddeyle işaretlenir ve sonuçlar bilgisayar programı ile analiz edilebilen dalgalara dönüştürülebilir (Şekil 1). Çeşitli bakterilerin alt-tiplendirilmesinde kullanılan yöntemin pulsed field-jel elektroforezi (PFGE)'den üstün olduğuna dair yayınlar bulunmaktadır[14-16].

“Arbitrarily Primed (Random Amplified)” Polimeraz Zincir Reaksiyonu (AP-PCR)

Bu yöntemde bilinen özgül bir DNA bölgesini çoğaltmak yerine randomize seçilen primerlerle DNA içindeki bölgeler çoğaltılır. Primerlerin bağlanma yerleri arasındaki uzaklık farklılıkları agaroz jelde saptanabilen farklı sayı ve uzunluktaki (baz çifti) bantların oluşmasına neden olur (Resim 3). Seçilen primerler çoğunlukla 10 baz civarındadır ve kavuşma (annealing) ısısı 40-50°C'ye düşürülmüştür. Böylece randomize seçilen primer dizisinin DNA içindeki birçok bölgeye bağlanması sağlanır, oluşan bantlar değerlendirmeye yetecek düzeydedir. 1990 yılında Welsh ve McCleland tarafından tanımlanan yöntem 1500'ün üstünde sitasyon almıştır ve her tür mikroorganizmanın analizinde kullanılmaktadır[17-18].

Uygulanma kolaylığı ve kısa sürede sonuç verebilme açısından geniş kullanım alanı bulan bu yöntemin en önemli dezavantajı primerlerin özel bir genetik bölgeye yönelik olmaması nedeniyle DNA'daki bağlanma yerlerinin seçilen primere, Mg konsantrasyonuna, kavuşma ısısına bağlı olarak değişiklik göstermesidir. Laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik oranı yüksek değildir.

AP-PCRyönteminin bir çeşidi olarak ökaryotlar ve prokaryotlarda bulunan DNA içindeki değişken sayıda tekrarlayan bölgelere örneğin “Repetitive Extragenic Palindrome (REP)” veya “Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)” bölgelerine yönelik primerler kullanılmaktadır. Bu bölgelerin fonksiyonları tam olarak bilinememekle beraber kromozomal organizasyonda yer aldıkları düşünülmektedir. REP veya ERIC dizilerinden kaynaklanan primerlerle yapılan PCR kolay uygulanabilmesi, çok sayıda izolat ile çalışılabilmesi, ayırtediciliğinin yüksek olması nedeniyle en yaygın kullanılan moleküler tiplendirme yöntemlerinden biridir (Resim 4) [19-21].

Mycobacterium türlerinin epidemiyolojik analizinde sıklıkla kullanılmaya başlanan bir yöntem olan spoligotipleme (spacer oligotyping) yöntemi IS6110 IS elementlerine yönelik olarak yapılan RFLP analizi ya da PCR yöntemine alternatif olarak önerilmektedir[22]. Bu yöntemde mikobakterilerde bulunan direkt tekrarlayan bölgeler “direct repeat (DR) locus” ların amplifikasyonu hedeflenmektedir. Suşlarda bu bölgenin varlığı ve sayısı değişkenlik gösterir. Bu bölgelere yönelik PCR sonrası amplifiye ürünler 43 set oligonükleotid içeren membran ile hibridize edilir, bu oligonükleotidlerin her biri DR loküsündeki spacer DNA dizilerinin tamamlayıcısıdır. Hibridize olan DNA'lar kemiluminesans yöntemle saptanır. Spoligotipleme ile üreme olduktan 1 gün sonra sonuca ulaşmak mümkün olmaktadır ve özellikle 6'dan az IS6110 içeren suşların analizinde önerilmektedir[23].

“PULSED FIELD” JEL ELEKTROFOREZİ

Moleküler tiplendirme yöntemlerinin altın standartı olarak kabul edilmektedir. Bu yöntemde besiyerlerinde üretilen bakteri erimiş agarozla karıştırılır ve küçük kalıplara dökülür. Tüm bakteri genomunu içeren agaroz plakları tüplere aktarılır ve deterjan- enzim lizisini takiben RE ile kesilir. Kesilmiş plaklar agaroz jeldeki çukurlara yüklenir ve elektroforez başlatılır. Önceden belirlenmiş aralıklarla ve farklı yönlerden akım verilerek 10-800 kb'lık DNA parçalarının jelde ilerlemesi sağlanır. PFGE neredeyse tüm bakterilerin epidemiyolojik ayrımında kullanılmıştır ve çoğu yayında ayırtediciliği en yüksek yöntem olduğu bildirilmektedir[24,25]. Jelin etidyum bromid ile boyanmasını takiben elde edilen bantlar değerlendirilebilir (Resim 5); bantların değerlendirilmesinde Tenover'in artık klasikleşmiş yöntemi gözönüne alınabilir[26]: Aynı paterni veren izolatlar-aynı, 1-3 bant farklılığı-çok yakın, 4-6 bant farklılığı-muhtemelen aynı, 6'dan fazla farklılık-ayrı.

Jel sonuçları fotoğraflanıp veriler piyasada bulunan dijital sistemlerden biri kullanılarak saklanabilir ve bilgisayar programları yardımıyla analiz edilebilir. Elde edilen dendrogramlar sonuçların yakınlığının gösterilmesinde okuyucuya kolaylık sağlamaktadır (Resim 6).

Bahsedilen tiplendirme yöntemlerinden hangisinin kullanılacağı laboratuvarın mali kaynaklarına, eğitimli teknisyenlerin varlığına ve epidemiyolojik olarak ne tür bilgilere ihtiyaç duyulduğuna bağlıdır. Bu yöntemlerin uygulama şekilleri, değerlendirilebilirlikleri ve yaklaşık fiyatları Tablo 1 ve Tablo 2'de verilmiştir[27,28]. Hangi yöntemin daha ayırtedici olduğu (typeability) ve tekrarlanıldığında alınan sonucun tutarlılığı (reproducibility) değişkenlik göstermektedir. Değerlendirilecek suş sayısı önemli bir belirleyicidir. Çok sayıda suşun analiz edilmesi gerekiyorsa kısa sürede uygulanabilecek, ucuz bir yönteme, REP-PCR gibi, ihtiyaç duyulurken; referans verilerinin belirlenmesinde gerekli genetik profilin çıkarılmasında PFGE veya AFLP tercih edilmelidir.

Etken mikroorganizmaların moleküler analizi infeksiyon kontrol programlarının en önemli yardımcılarındandır. İnfeksiyon kontrol komitesi ve klinik mikrobiyoloji laboratuvarının ortak çalışmasıyla salgınlara neden olan organizmanın fenotipinin yanısıra genotipinin belirlenmesi infeksiyon kaynağının belirlenmesi suretiyle epidemileri önleyebilir ya da salgının süresini kısaltabilir. Hacek ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada, hastane infeksiyonlarında mikrobiyal klonalitenin rutin olarak belirlenebilmesi durumunda 2 yıl gibi bir sürede 4 milyon dolarlık kazanç sağlandığını göstermişlerdir[29]. Ülkemiz koşullarında ekonomik ve teknik nedenlerle her klinik mikrobiyoloji laboratuvarında genotipleme yapmak anlamlı görülmemektedir. Bununla birlikte belirli mikroorganizmaların tiplendirilmesinde uzmanlaşmış, donanımlı referans laboratuvarlarının gerekliliği açıktır. Uygun koşullarda bir postalama sistemiyle suş naklinin sağlanması ve izole edilen suşların genotipleme bedelinin devlet kurumlarınca karşılanan ödeme listelerine girmesi durumunda ülkemiz de epidemiyolojik analiz konusunda uluslararası düzeyde veri üretebilir duruma gelebilecektir.

KAYNAKLAR

  1. Persing DH, Smith TF, Tenover FC, Thomas JW. Diagnostic molecular microbiology. Principles and Applications. Washington DC: ASM 1993.
  2. Loutit JS, Tompkins LS. Restriction enzyme and southern hybridization analyses of Pseudomonas aeruginosa strains from patients with cystic fibrosis. J Clin Microbiol 1991;29:2897-900.
  3. van Embden J, Cave D, Crawford J, et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol 1993;31:406-9.
  4. van Soolingen DP, Hermans PEW, de Haas PE, Soll DR, van Embden JDA. Occurence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol 1991;29:2578-86.
  5. Sayada C, Denamur J, Orfila F, Catalan F, Elion J. Rapid genotyping of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein by the polymerase chain reaction. FEMS Microbiol Lett 1991;83:73-8.
  6. Vines A, Reeeves S, Hunter S, Swaminathan B. Restriction fragment length polymorphism in four virulance associated genes of Listeria monocytogenes. Res Microbiol 1992;143:281-94.
  7. Kostman J, Edlind J, LiPuma J, Stull T. Molecular epidemiology of Pseudomonas cepacia. J Infect Dis 1992; 164:133-6.
  8. Shortridge VD, Stone G, Flamn R, et al. Molecular typing of Helicobacter pylori isolates from a multicenter US clinical trial by ureC restriction fragment length polymorphism. J Clin Microbiol 1997;35:471-3.
  9. Gzyl A, Augustnowicz E, Dzierzanowska D, et al. Genotypes of Helicobacter pylori in Polish population. Acta Microbiol Pol 1999;48:261-75.
  10. Okhravi N, Adamson P, Mant R, et al. Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism mediated detection of Candida species causing intraocular infection. Invest Ophthalmol Vsi Sci 1998;39: 859-66.
  11. Chanawong A, Mzali FH, Heritage J, Lulitanond A, Hawkey PM. Characterization of extended spectrum beta-lactamases of the SHV family using a combination of PCR-single strand conformational polymophism and PCR-restriction fragment lenght polymorphism. FEMS Microbiol Lett 2000;184:85-9.
  12. Cockerill F, Uhl J, Temesgen Z, et al. Rapid identification of a point mutation of the Mycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase (katG) gene associated with isoniazid resistance. J Infect Dis 1995;171:240-5.
  13. Nieman S, Harmsen D, Rusch-Gerdes S, Richter E. Differentiation of clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates by gyrB sequence polymorphism analysis. J Clin Microbiol 2000;38:3231-4.
  14. Nair S, Screiber E, Thong KL, Pang T, Altwegg M. Genotyping characterization of Salmonella typhi by amplified fragment length polymorphism provides increased discrimination as compared to pulsed- field gel electropheresis and ribotyping. J Microbiol Methods 2000;41: 35-43.
  15. Gibson JR, Slater E, Xerry D, Tompkins D, Owen R. Use of amplified fragment length polymorphism technique to fingerprint and differentiate isolated of Helicobacter pylori. J Clin Microbiol 1998;36:2580-5.
  16. Speijer H, Savelkoul PH, Bonten MJ, Stobberingh EE, Tjhie JH. Application of different genotyping methods of Pseudomonas aeruginosa in a setting of endemicity in an intensive care unit. J Clin Microbiol 1999;37:3654- 61.
  17. van Belkum A. DNA figerprinting of medically important microorganisms by use of PCR: A literature review. Clin  Microbiol Rev 1994;7:174-84.
  18. Ralp D, McCleland M. Arbitrarily primed PCR methods for studying bacterial diseases. In: Woodford N, Johnson P (eds). Methods in Molecular Medicine. Vol 15. Molecular Bacteriology: Protocols and Clinical Applications. Totowa: Humana Press Inc NJ 1998:60-75.
  19. Eskitürk A, Ener B, Quint W. Nötropenik hastaların tekrarlayan orofaringeal kandidoz ataklarından izole edilen Candida albicans suşlarının genotipik analizi. Flora 1997;2:16-20.
  20. Yağcı A, Çıragil P, Över U, Şener B, Erturan Z, Söyletir G. Farklı hastanelerde izlenen kistik fibroz hastalarından izole edilen Pseudomonas aeruginosa suşlarının virülans faktörleri ve genotipik dağılımının belirlenmesi. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi 1998;28:29-33.
  21. van der Zee A, Verbakel H, van Zon J, et al. Molecular genotyping of Staphylococcus aureus strains: Comparison of repetitive element sequence based PCR with various typing methods and isolation of novel epidemicity marker. J Clin Microbiol 1999:342-49.
  22. Kamerbeek J, Schouls L, Arend K, et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol 1997;35:907-14.
  23. Bauer J, Andersen A, Kremer K, Miorner H. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS6110 low-copy number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark. J Clin Microbiol 1999;37:2602-6.
  24. Kaufman ME. Pulsed field gel electrophoresis. In: Woodford N, Johnson AP (eds). Methods in Molecular Medicine. Vol 15. Molecular Bacteriology: Protocols and Clinical Applications. Totowa: Humana Press NC 1998:35-50.
  25. Yağcı A, Çerikçioğlu N, Kaufmann ME, et al. An outbreak of Myroides odoratimimus (Flavobacterium odoratum) urinary tract infections investigated by PCR fingerprinting and pulsed field electropheresis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;19:731-2.
  26. Tenover FC, Arbeit RV, Goering P, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electropheresis: Criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995;33:2233-9.
  27. Olive M, Bean P. Principles and applications of methods for DNA based typing of microbial organisms. J Clin Microbiol 1999;37:1661-9.
  28. Pfaller M. Molecular approaches to diagnosing and managing infectious diseases: Practicality and costs. Emerg Infect Dis 2001;7:312-8.
  29. Hacek D, Suriano T, Noskin G, et al. Medical and economic benefit of a comphrehensive infection control program that includes routine determination of microbial clonality. Am J Clin Pathol 1999;111:647-54.

Yazışma Adresi:

Doç. Dr. Ayşegül YAĞCI

Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi

Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Haydarpaşa - İSTANBUL

Makalenin Geliş Tarihi: 08.05.2001   Kabul Tarihi: 04.06.2001

Yazdır