Çeşitli Bakterileri Tanımlamada Kromojenik CPSID2 Besiyerinin Değerlendirilmesi#
Ayşe Esra KARAKOÇ*, Hikmet UNCU*, Ayfer ÖZIŞIK*, Nilgün ACAR*
* S.B. Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Bölümü, ANKARA
ÖZET
CPS ID2, idrar örneklerinin değerlendirilmesi için önerilen kromojenik bir besiyeridir. Besiyerindeki kromojenik substratların bakterilerin enzimleriyle parçalanması sonucu oluşturduğu farklı renklerdeki son ürünler kolonilerin renklerine göre tanımlanmalarını sağlar. Çalışmamızda, hazır, ticari formda temin edilmiş olan CPS ID2 besiyerinin, laboratuvarımızda daha önceden izole edilmiş farklı bakteri suşlarını tanımlamadaki başarısını değerlendirmek amaçlanmıştır. Çeşitli klinik örneklerden izole edilmiş ve tür düzeyinde tanımlanmış 423 suşun, 2 mL serum fizyolojik içerisinde 108 CFU/mL bakteri sayısına eşit süspansiyonu, kanlı (Pronadisa) veya EMB (Pronadisa) besiyerleri ile CPS ID2 (BioMérieux) besiyerine ekildi. Kromojenik besiyerinde elde edilen saf kültürler koloni renklerine göre tanımlandı. Renk ile yapılan tanımlama klasik mikrobiyolojik yöntemlerle yapılmış olan tanımlama ile karşılaştırıldı. Escherichia coli ATCC 27853 ve Enterococcus faecalis ATCC 29212 kontrol suşları ile besiyerlerinin kalite kontrolleri yapıldı. Toplam 83 E. coli'nin 79 (%95.2)'u pembe-koyu kırmızı renkte koloniler oluştururken, 4 (%4.8)'ü şeffaf koloniler oluşturdu. Proteus (n: 11), Morganella (n: 4), Providencia (n: 1) (PMP)'nın her 3'ü de etrafı kahverenginde şeffaf koloniler oluşturdu. Klebsiella (n: 60), Enterobacter (n: 43), Serratia (n: 10) (KES) türleri oluşturdukları metalik mavi-yeşil, turkuaz rengindeki koloniler ile diğer Enterobacteriaceae üyelerinden ayırt edildi. Ancak gerek PMP gerekse KES gruplarında tür düzeyinde identifikasyon için ek biyokimyasal test yapılması gerektiği görüldü. Tüm enterokoklar (n: 55) mavi-yeşil, turkuaz rengindeki kolonileri ile kolaylıkla tanımlandı. Diğer bakteri gruplarında koloni renginin yeterince ayırt ettirici olmadığı görüldü. Birer adet A ve C grubu streptokok dışında CPS ID2 besiyerinde üremeyen suş olmadı.
Anahtar Kelimeler: Kromojenik besiyeri, Gram-negatif basil, Enterokok
SUMMARY
The Evaluation of Chromogenic CPS ID2 Medium in the Identification of Bacterial Isolates
CPS ID2 is a chromogenic medium defined for the urinary specimens. The final products with different colours produced by the bacterial enzymatic degradation of the chromogenic substrates within the medium make it possible for bacterial colonies to be identified in terms of colony colour. In this study we aimed to evaluate the use of CPS ID2 medium in defining pre-identified, clinical bacterial isolates in terms of the colony colour they produce in the media. Suspensions in sterile physiological saline corresponding to a colony count of 108 CFU/mL of bacteriae were prepared with a total of 423 bacterial isolates from various clinical specimens all of which were inoculated to blood agar or EMB and CPS ID2 media. Bacterial identification using colony colour on chromogenic media was compared with the identification made by conventional tests. The quality control of the media was performed using Escherichia coli ATCC 27853 and Enterococcus faecalis ATCC 29212. A total of 79 (95.2%) E. coli out of 83 created typical pink-dark red coloured colonies whereas 4 (4.8%) grew as transparent without creating any colour. Proteus (n: 11), Morganella (n: 4), Providencia (n: 1) (PMP) produced translucent colonies with a brown hue around. Klebsiella (n: 60), Enterobacter (n: 43), Serratia (n:10) (KES) were recognised as metallic, blue-green, large colonies, also defined as having a turquoise colour. Yet a small number of tests needed to be planned in order for bacteria included in PMP and KES groups to be defined in species level. All enterococci (n: 55) were readily identified by the small, blue-green, turquoise colonies. In the rest of the bacterial groups colony colour did not provide adequate information for bacterial identification. Except for one group A and one group C streptococci no failure of isolation was observed with the media under test.
Key Words: Chromogenic media, Gram-negative bacilli, Enterococci
#Bu çalışma, XXIX. Türk Mikrobiyoloji Kongresi'nde poster olarak sunulmuştur.
Bir klinik mikrobiyoloji laboratuvarının ana fonksiyonlarından biri hastadan gelen örnekleri potansiyel patojen mikroorganizmaların varlığı yönünden değerlendirmek, klinisyene hastasını tedavi etmesine yardım edecek bilgiyi en çabuk ve en ekonomik yoldan sağlamaktır. Bir laboratuvar çalışmasının değerlendirilmesinde zamanında verilen bir ön rapor, laboratuvar testlerinin kesinlik, doğruluk değerlendirmesi kadar önem taşır. Erken verilen bir muhtemel rapor, kesinleşmiş, doğrulanmış, ancak gecikmiş bir rapordan çok daha faydalıdır.
Gram-negatif basil ve enterokok türleri hastanede yatan hastalarda önemli infeksiyon etkenleridir. Giderek artan sıklıkta antimikrobiyal direncin rapor edildiği mikroorganizmaların hızlı identifikasyonunun yapılması, klinisyene süratle etken mikroorganizma hakkında bilgi verilmesi ve uygun antibiyotik seçiminin sağlanması açısından önemlidir[1,2].
Klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında koliformlar ve enterik patojenlerin ayırt edilmesi için en sık MacConkey ve EMB (Levin) besiyerleri kullanılmaktadır[1]. Bunlar, gram-negatif bakterileri laktozu kullanma özelliğine göre ayırt eden besiyerleridir[3]. Laktoz negatif ya da pozitif olduğu belirlenen bakterinin ek biyokimyasal testlerle identifiye edilmesi gerekir.
Mikrobiyoloji laboratuvarlarında kromojenik besiyerleri farklı amaçlarla kullanılmıştır[4,5]. Yapılan çalışmalarda, bu besiyerlerinin bazı gram-negatif ve gram-pozitif mikroorganizmaların identifikasyonlarını, oluşturdukları koloni rengi ve morfolojisi ile kolaylaştırdığı gösterilmiştir[6,7]. Besiyerinde bulunan kromojenik substratların bakteri enzimleri ile parçalanması sonucu oluşan farklı renklerdeki son ürünler kolonilerin renklerine göre tanımlanmalarını sağlar. Patojen bakterilerin 18-24 saatlik bir inkübasyon sonrasında koloni renklerine göre isimlendirilebilmesi, mümkün olan en kısa sürede çıkan bir ön raporun önemli olduğu, klinik mikrobiyoloji laboratuvarları için avantajlı ve işe yarar gözükmektedir. CPS ID2, idrar örneklerinin değerlendirilmesinde önerilen yeni jenerasyon kromojenik bir besiyeridir.
Bu çalışmada, hazır, ticari formda temin edilmiş olan CPS ID2 besiyerinin, laboratuvarımızda daha önceden izole edilmiş farklı bakteri suşlarını tanımlamadaki başarısını değerlendirmek amaçlanmıştır.
MATERYAL ve METOD
Bu çalışma, Ekim 1999-Ocak 2000 tarihleri arasında Ankara Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarında yapıldı.
Bakteri Türleri
Laboratuvarda kan, idrar, yara, boğaz, dışkı gibi farklı kinik örneklerden izole edilmiş, cins ve/veya tür düzeyinde tanımlanmış toplam 423 suş çalışma kapsamına alındı. Bu suşlar; 83'ü Escherichia coli, 60'ı Klebsiella spp., 43'ü Enterobacter spp., 10'u Serratia spp., 11'i Proteus spp., 4'ü Morganella morganii, 1'i Providencia stuartii, 10'u Citrobacter freundii, 7'si Salmonella spp., 2'si Shigella sonnei, 2'si Yersinia spp. olmak üzere toplam 233 Enterobacteriaceae, 38'i Pseudomonas spp., 36'sı Acinetobacter spp., 2'si Aeromonas hydrophilia olmak üzere toplam 76 Enterobacteriaceae dışı gram-negatif bakteri, 55'i enterokok, 51'i stafilokok, 8'i streptokok olmak üzere toplam 114 gram-pozitif kok idi. CPS ID2 besiyeri özellikle üriner patojenlerin değerlendirilmesi için önerilen bir besiyeri olduğundan, laboratuvarda en sık izole edilen üriner patojen olması nedeniyle çalışmaya daha fazla sayıda E. coli suşu (n: 83, %19.6) dahil edildi.
E. coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212 kontrol suşları ile besiyerlerinin kalite kontrolleri yapıldı.
Besiyerleri
CPS ID2 besiyeri (BioMèrieux), 90 mm'lik petrilerde hazır olarak temin edildi. Besiyerleri ışıktan korunarak, 2-8°C'de saklandı. Kanlı agar (Pronadisa) ve EMB (Pronadisa) dehidrate besiyerleri olarak temin edildi.
Nutrient agarda, oda ısısında muhafaza edilmekte olan 423 suştan gram-pozitif koklar kanlı agara, gram-negatif bakteriler EMB besiyerine pasajlandı. Pasajlardan elde edilen saf kültürler 2 mL steril standart serum fizyolojiğe inoküle edildi. Serum fizyolojikle hazırlanan süspansiyonun bakteri sayısı 108 CFU/mL'ye ayarlandıktan sonra 0.01 mL'si kalibre özelerle CPS ID2 besiyerine ekildi.
35 ± 2°C'de bir gece inkübasyon sonrası kromojenik besiyerinde elde edilen saf kültürler Tablo 1'de belirtilen koloni renklerine göre tanımlandı. Renk ile yapılan tanımlama klasik mikrobiyolojik yöntemlerle yapılmış olan identifikasyon ile karşılaştırıldı.
BULGULAR
Test edilen E. coli suşlarının 79 (%95.2)'u kromojenik besiyerinde pembe-koyu kırmızı renkte koloni oluşturdu (Resim 1). 0-nitrofenil-ß-D-galaktopiranosid (ONPG) testi negatif bulunan 4 (%4.8) suş renk yapmayan, şeffaf koloni meydana getirdi.
Proteus mirabilis (n: 9) etrafında yaygın kahverengi zonu olan şeffaf koloniler oluşturdu (Resim 2). Proteus vulgaris (n: 1) ve Proteus penneri (n: 1) kolonileri P. mirabilis'e benzer görünümdeydi. P. stuartii (n: 1) Proteus kolonisine benzer görünümde etrafı kahverengi pigmentli ortası yeşil renkte koloniler oluşturdu (Resim 2). M. morganii (n: 4) etrafında kahverengi pigment olan şeffaf koloniler oluşturdu. Proteus, Providencia ve Morganella türlerinin (n: 16) kromojenik besiyerinde meydana getirdikleri kolonilerin renk ve morfolojileri benzerdi. Proteus, Morganella, Providencia (PMP) grubu olarak ortak tanımlanmayı mümkün kılan kromojenik besiyerindeki koloni özellikleri bu bakteri gruplarını birbirinden ayıramadı.
Klebsiella (n: 60), Enterobacter (n: 43), Serratia (n: 10) (KES) suşlarının her 3'ü de benzer renk ve morfolojide koloniler oluşturdu. Bunlar, metalik mavi-yeşil, turkuaz renginde kolonilerdi (Resim 1). Ayırt ettirici bir özellik olmamakla birlikte Enterobacter ve Serratia kolonileri, Klebsiella'ya göre daha açık renkli ve daha küçüktü. Toplam 43 Enterobacter içerisinde bir Enterobacter cloacae pigment yapmayan, şeffaf-sarı görünümde koloni oluşturdu. KES grubu olarak ortak tanımlanmayı sağlayan kromojenik besiyerindeki koloni özellikleri bu bakteri gruplarını birbirinden ayıramadı.
Tüm enterokoklar (n: 55) benzer morfolojide küçük, mavi-yeşil, turkuaz renginde koloniler oluşturdu (Resim 3). Koloni rengi KES grubununkine benzemesine rağmen, koloni çapı ve morfolojisi ile KES grubundan kolaylıkla ayırt edildi. Çalışmaya dahil edilen enterokoklar içerisinde kromojenik besiyerinde farklı koloni rengi ve morfolojisi oluşturan olmadı.
Enterokoklardan koloni rengi ve morfolojisi ile ayırt edilen grup B streptokoklar ve grup D nonenterokoklar (n: 4), laciverte yakın koyu mavi veya koyu pembe-kırmızı koloniler yaptı (Resim 3). A ve C grubu streptokokların (n: 4) ikisi CPS ID2 besiyerinde çok küçük, özellikleri ayırt edilemeyen koloniler oluştururken, diğer ikisinde üreme gözlenmedi.
Staphylococcus aureus (n: 20) sarı renkte, mat koloniler oluşturdu. Koagülaz negatif stafilokoklar (KNS) (n: 29) daha açık renkli parlak koloniler oluşturdu. İki Streptococcus saprophyticus'dan 1 tanesi pembe renkte koloni oluşturdu. Stafilokok türleri için koloni rengi ve morfolojisi ayırt ettirici bulunmadı.
Pseudomonas aeruginosa (n: 35), sarı-yeşil-kahverenginde koloniler oluşturdu. Pseudomonas spp. (n: 2) ve Pseudomonas putida (n: 1) kolonileri şeffaf-sarı renkteydi.
Citrobacter freundii (n: 10) suşlarının 8'i şeffaf-sarı koloniler yaptı. Ancak ikisinin E. coli kolonilerine benzer şekilde pembe-koyu kırmızı renkte koloniler oluşturduğu görüldü.
S. sonnei (n: 2) suşları E.coli'ye benzer şekilde pembe-koyu kırmızı koloniler oluşturdu.
Yersinia (n: 2), Acinetobacter baumanii (n: 33) ve Acinetobacter lwoffi (n: 3) CPS ID2 besiyerinde renksiz koloniler oluşturdu. Tablo 1 ve Tablo 2'de test edilen bakterilerin kromojenik besiyerinde oluşturdukları koloni renk ve morfolojileri gösterilmiştir. Tablo 3'te tek başına kromojenik besiyerinde oluşturdukları koloni rengi ile tanımlanamayan bakteriler verilmiştir.
TARTIŞMA
Kromojenik besiyerleri ile bugüne kadar su, yiyecek ve biyolojik sıvılardan E. coli'lerin spesifik izolasyonu sağlanmıştır[8-10]. CPS ID2, idrar örnekleri için önerilen kromojenik bir besiyeridir[6,7,11]. Bu besiyerlerinde bazı bakteriler, örneğin E. coli oluşturdukları koloni rengi ve morfolojisi ile tür düzeyinde identifiye edilirken, bazı bakterilerde az sayıda ilave biyokimyasal testin yapılması gerekmektedir.
Bu çalışma, laboratuvarımızda cins ve/veya tür düzeyinde identifiye edilmiş klinik bakteri izolatlarının sözkonusu besiyerinde meydana getirdikleri koloni renk ve morfolojilerini değerlendirmek amacıyla planlanmıştır.
Çalışmamızda CPS ID2 besiyeri, E. coli ve enterokokları yalnız koloni rengi ve morfolojisi ile identifiye etmiş, ek biyokimyasal test yapılması gerekmemiştir. PMP ile KES ise birer grup olarak tanımlanmış ve tür düzeyinde identifikasyon için ek biyokimyasal test yapılması gerektiği görülmüştür.
Çalışmamızda test edilen E. coli'ler, besiyerinde %95.2 (79/83) oranında pembe-koyu kırmızı renkte koloni oluşturmuş; dolayısıyla ß-D-glukuronidaz enzimleri pozitif bulunmuştur. Diğer bir çalışmada da benzer oranlardan söz edilmektedir[12]. ß-D-glukuronidaz enzimini E. coli dışında Salmonella, Shigella, Yersinia, C. freundii ve KNS de üretir[13,14]. Nitekim çalışmamızda S. sonnei (n: 2) ve C. freundii (n: 2)'nin, oluşturdukları ß-D-glukuronidaz enziminden dolayı, kromojenik besiyerinde E. coli ile benzer, pembe-koyu kırmızı renkte koloniler yaptığı tespit edilmiştir. S. sonnei'nin idrar kültür örneklerinde izolasyon oranı düşük olduğu için E. coli ile karıştırılması mümkün gözükmemektedir. Citrobacter-E. coli ayrımında ise, besiyerinin kullanıldığı örnek grubu (yatan hasta/poliklinik), dolayısıyla Citrobacter ile karşılaşma olasılığı gözönüne alınarak, tek başına indol testi kullanılıp E. coli-C. freundii ayrımı yapılabileceği gibi, indol ve sitrat utilizasyon testleri kullanılarak E. coli-C. freundii-Citrobacter diversus ayrımı da yapılabilir.
Enterokoklar CPS ID2 besiyerinde yalnız koloni renk ve morfolojisi ile cins düzeyinde tanımlanabilmiş, tür düzeyinde identifikasyon için ek biyokimyasal test gerekmiştir.
B grubu streptokok kolonilerinin, net bir turkuaz renk yapan enterokok kolonilerine göre daha açık renkte veya laciverte yakın koyu-mavi renkte olduğu görülmüştür. Açık renkli olanların inkübasyon süresi uzatıldığında yine enterokoklardan çok farklı koyu-mavi renkte koloniler oluşturduğu tespit edilmiştir. D grubu nonenterokoklar B grubu streptokoklara benzer koloniler yapmış, birbirinden ayrılamayan bu bakteriler enterokoklardan kolaylıkla ayırt edilebilmiştir.
E. coli ve enterokok türleri üriner sistem infeksiyonu (ÜSİ)'nda sık karşılaşılan etkenlerdir[1,2,15]. Kromojenik besiyeri her ikisi için de yeterli identifikasyon sağlamaktadır. ÜSİ'nin büyük bir çoğunluğunda E. coli'nin etken olduğu ve bu bakterinin nozokomiyal ve toplumdan kazanılmış ÜSİ'nin en sık etkeni olduğu düşünülürse, kromojenik besiyerinin idrar kültür örneklerinde primer tarama besiyeri olarak kullanılması uygun gözükmektedir[5-7,16].
KES grubunda yer alan bakteriler kromojenik besiyerinde ortak tanımlanmalarını sağlayan renk ve morfolojide koloniler oluşturmuştur (Tablo 1). Ancak bu grupta yer alan bakterilerin birbirinden ayrımının yapılabilmesi için, ek biyokimyasal testlerin planlanması ve yapılması gereklidir.
Proteus türleri özellikle de P. mirabilis, idrardan sık izole edilen bir bakteriyel patojendir[17]. Kromojenik besiyerinde P. mirabilis etrafı kahverengi, şeffaf koloniler yapmaktadır. M. morganii ile P. vulgaris de P. mirabilis ile benzer kahverengi koloniler yaptığı için, bu bakterilerin tanımlanması indol ve ornitin dekarboksilaz testleri ile mümkün olmaktadır. Besiyerinin Proteus türlerinin yayılmasını inhibe etmesi önemli bir avantajıdır. Bu şekilde birden çok etkenin ürediği kültürlerde, Proteus'lar yayılarak diğer kolonileri örtmemekte; diğer bakterilerin de izolasyonu ve identifikasyonu mümkün olmaktadır.
Gerek PMP gerekse KES grupları besiyerinde 18-24 saatlik inkübasyon sonrasında grup olarak isimlendirilmiştir. Dolayısıyla besiyeri etkenin ön tanımlamasının yapılması, klinisyene ön bilgi verilmesi yönünden zaman kazandırıcıdır. Bir klinik mikrobiyoloji laboratuvarının ana fonksiyonunun hastadan gelen örnekleri potansiyel patojen mikroorganizmaların varlığı yönünden değerlendirmek, potansiyel patojen ve muhtemel identifikasyonu mümkün olan en erken dönemde rapor etmek olduğu düşünülürse, test edilen besiyeri yönlendirici gözükmektedir. Diğer taraftan test edilen besiyerinin kullanımı bu iki bakteri grubunun tür düzeyinde identifikasyonu yönünden, Enterobacteriaceae içindeki olasılık sayısını oldukça düşürmektedir; dolayısıyla yapılması gereken test sayısı azalacaktır. Ön rapor bilgisi vermenin yanısıra besiyeri, laboratuvarın gerek laboratuvar malzemesi gerekse iş gücünden tasarrufunu sağlayacaktır.
Kromojenik besiyeri Pseudomonas ve Acinetobacter gibi nonfermentatif bakterilerin üremesine izin verir. P. aeruginosa suşları besiyerinde oluşturdukları sarı-yeşil kahverenginde koloniler ve tipik kokuları ile ilk değerlendirmede ön bilgi sağlarlar ancak oksidaz testi, oksidasyon/fermentasyon-glukoz test mediuma ekim gibi ileri testler ile identifiye edilirler. Renksiz, beyaz koloni oluşturan Acinetobacter'lerin ve pigment oluşturmayan bir kısım Pseudomonas türlerinin ise rutin laboratuvar protokolleri doğrultusunda identifiye edilmeleri gerekir.
Aeromonas'lar benzer biçimde CPS ID2 besiyerinde renksiz koloniler oluşturduğu için ayırt edilememiş, klasik biyokimyasal testlerle identifikasyonları gerekmiştir.
S. aureus ve KNS türleri birinin mat sarı, diğerinin parlak sarı-beyaz koloni oluşturması ile ayırt edilebilir gözükmesine karşın, tek başına koloni renk ve morfolojisinin plazma koagülaz testi, novobiosin duyarlılık testi gibi identifikasyona dönük ek test ihtiyacını ortadan kaldırmadığı düşünülmüştür.
Çalışmada değerlendirilen toplam 423 suştan bir A ve bir C grubu streptokok olmak üzere toplam 2 suş dışında CPS ID2 besiyerinde üremeyen olmamıştır. Dolayısıyla besiyeri, hem genel izolasyon amaçlı kanlı agarda hem de gram-negatif basillerin izolasyonunda kullanılan selektif EMB besiyerinde üreyen mikroorganizmaların tamamını izole edebildiğinden, özellikle önerildiği idrar örneklerinde ilave bir besiyeri olmaksızın tek başına kullanılabilir gözükmektedir.
KAYNAKLAR
Yazışma Adresi:
Dr. Ayşe Esra KARAKOÇ
S.B. Ankara Eğitim ve Araştırma
Hastanesi Mikrobiyoloji ve
Klinik Mikrobiyoloji Bölümü
ANKARA
Makalenin Geliş Tarihi: 05.01.2001 Kabul Tarihi: 06.09.2001