A Grubu Beta Hemolitik Streptokoklarda Penisilin Toleransı ve Eritromisin Direncinin Araştırılması
Engin KARAKEÇE*, Jale TAŞÇIOĞLU*
* Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarı,
İSTANBUL
ÖZET
Çeşitli örneklerden izole edilen 101 adet A grubu beta hemolitik streptokok kökeninde “National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)” kılavuzuna uygun olarak mikrodilüsyon yöntemiyle penisilinin minimum inhibitör konsantrasyon (MİK), minimum bakterisidal konsantrasyon (MBK) değerleri saptanmış ve MBK/MİK oranları değerlendirilerek tolerans araştırılmıştır. Aynı kökenlerde eritromisin MİK değerleri de belirlenmiştir. MBK/MİK oranları 32 veya daha büyük kökenler penisilin toleran, MİK değeri 4 µg/mL veya büyük olan kökenler eritromisin dirençli olarak değerlendirilmiştir.
Sonuç olarak 101 kökenin hiç birisinde penisilin direnci bulunmamış ve bir köken Eagle fenomeni olarak değerlendirilmiştir. Eritromisin direnci ise %5 oranında saptanmıştır.
Anahtar Kelimeler: A grubu beta hemolitik streptokoklar, Penisilin toleransı, Eritromisin direnci
SUMMARY
Penicillin Tolerance and Erythromycin Resistance in Group A Beta Hemolytic Streptococci
One hundred and one group A beta hemolytic Streptococcus strains isolated from various samples were investigated for penicillin tolerance and erythromycin resistance. Penicillin MIC and MBC values were detected according to the methods of National Committee for Clinical Laboratory Standards. The strains having MBC/MIC ratio equal to or higher than 32 for penicillin were evaluated as penicillin tolerant and the strains having MIC values ≥ 4 mg/mL for erythromycin were evaluated as erythromycin resistant.
As a result, there wasn't any penicillin resistance detected but one strain was evaluated as Eagle phenomenon. Erythromycin resistance rate was detected as 5%.
Key Words: Group A beta hemolytic streptococci, Penicillin tolerance, Erythromycin resistance
Kırk yılı aşkın süredir penisilin streptokok infeksiyonlarının tedavisinde kullanılan ilk seçenek olmuştur. Ancak son 20 yılda özellikle A grubu beta hemolitik streptokok (AGBHS)'ların üst solunum yollarından eradikasyonunda, %6-38 oranlarında tedavide başarısızlık saptanmıştır[1-3]. Tedavide başarısızlığın nedeni veya nedenleri kesin olarak açıklanabilmiş değildir. Bu başarısızlığın nedenleri arasında; ağız ve üst solunum yollarının normal florasını oluşturan aerob ve anaerob bakterilerin beta-laktamaz enzimi salgılayarak penisilini inaktive etmesi yanısıra yetersiz penisilin dozu, tedavinin kısa süreli olması, ilacın farinks ve tonsil dokusuna emiliminin yetersiz olması, AGBHS taşıyıcılığı, okul ya da aile ortamından alınan aynı ya da başka bir köken ile infeksiyonun tekrarlanması, doz artımına rağmen tedavinin etkili olmadığı durumlarda penisilin toleransı sayılabilir[1,2,4-6]. Normal konakta oluşan yaygın infeksiyonlarda, özellikle doğal savunma sistemleri bozulmuş hasta grubunda, toleransın saptanması klinik olarak önem kazanmıştır[1,2,4-6].
Tolerans; bir bakterinin, beta-laktam antibiyotiklerin ve hücre duvarı sentezini inhibe eden diğer antibiyotiklerin öldürücü ve aynı zamanda eritici etkisine karşı ölüm oranlarının düşük olması, yani bakterisid antibiyotiklerin bakteriye sadece bakteriyostatik etki göstermesidir[6]. Penisiline karşı tolerans mekanizması, özellikle otolitik sistemde defekt olması, bakteride penisilin molekülüne karşı penetrasyon bariyerinin varlığı ve penisilin bağlayan proteinlerdeki değişikliklerle açıklanmaktadır[7]. Bakterilerde antibiyotik toleransını belirlemek için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bunu saptamanın en sağlıklı yolu zamana göre kültürde canlı kalan bakteri oranının işaretlendiği zaman-ölüm grafiğini çizmektir. Ancak çok zahmetli, standardize edilmemiş ve laboratuvarda bir çok köken için uygulanabilecek bir yöntem değildir. Toleransın belirlenmesinde en çok kullanılan yöntem, MBK/MİK oranının saptanmasına dayanan yöntemdir. MBK/MİK oranı 32 veya daha fazla olan kökenler toleran olarak kabul edilir. Ayrıca kalıp çıkarma (gradient-replika plate yöntem), tolerans yüzdesinin saptanması, kolay uygulanabilen disk yöntemi de önerilmektedir[6,8].
Eritromisin, penisilin allerjisi olanlar için seçilecek antibiyotik olmasının yanısıra, penisilin toleran kökenlerle meydana gelen infeksiyonların tedavisinde de son derece etkili bulunmuştur. Ancak son yıllarda bu antibiyotiğin yaygın kullanımı, AGBHS'lerin eritromisine karşı direnç gelişimine neden olmuştur. Bu nedenle özellikle penisilin allerjisi olan hastalarda, bu antibiyotiğe karşı duyarlılığın araştırılması önerilmektedir[3,9].
Bu çalışma, AGBHS'lerin penisilin G toleransını ve eritromisin dirençli kökenlerin oranını saptamak için yapılmıştır.
MATERYAL ve METOD
Bu çalışmada Ocak 1998-Aralık 1998 tarihleri arasında Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarı'na gelen çeşitli örneklerden izole edilen, 101 adet AGBHS kökenleri çalışma kapsamına alınmıştır. %5 koyun kanlı agarda (Besimik) beta hemoliz yapan, gram-pozitif kok görünümünde, katalaz negatif kolonilerden basitrasine (0.04 U Oxoid) duyarlı, trimetoprim (1.25 mg)-sulfametoksazole (23.75 mg) (Oxoid) dirençli olanlar AGBHS olarak tanımlanmıştır. Tanımlanmış kökenlerin, lateks aglütinasyon (Oxoid) yöntemi ile AGBHS oldukları doğrulanmıştır.
Bakteri kültür süspansiyonunun hazırlanması için taze örneklerden direkt, dondurulmuş örneklerden ise çalışmaya başlamadan 3 gün önce oda ısısında çözülerek, %5 koyun kanlı agara pasaj yapılmış ve %3-5 CO2'li ortamda, 37°C'de bir gecelik inkübasyona bırakılmıştır. Bu kültürlerden 8-10 koloni alınıp, 4 mL Todd-Hewitt Broth'a pasaj yapılmış ve 37°C'de bir gecelik inkübasyona bırakılmıştır. Bu şekilde elde edilen geç logaritmik faz kültürlerinden 100 µL alınarak, 4 mL Todd-Hewitt Broth'a aktarılmıştır[10]. 37°C'de 2-4 saat %5 CO2'li ortamda inkübe edilen geç logaritmik faz kültürlerinin bulanıklığı, spektrofotometrede 540 nm dalga boyunda O.D. 0.1 (~1 x 107 cfu/mL) olacak şekilde ayarlanmıştır. Bakteri süspansiyonları 1/10 oranında sulandırıldıktan sonra kullanılmıştır[10].
Antibakteriyel etkinin saptanması için “National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)” kurallarına uygun olarak mikrodilüsyon yöntemi ve Todd-Hewitt Broth kullanılmıştır[10-12]. 100 µL Todd-Hewitt Broth'da 4-0.0039 µg/mL olacak şekilde penisilin ve eritromisin seri dilüsyonları yapılmıştır. Ayarlanan logaritmik faz bakteri süspansiyonundan 100 µL her kuyucuğa eklenmiştir[13]. Böylece ~5 x 105 cfu/mL bakteri yoğunluğu elde edilmiştir[10,12]. Bakteri üreme kontrolü için son kuyucuğa antibiyotik süspansiyonları konulmamıştır. 37°C'de 24 saat inkübasyondan sonra üremenin görülmediği en düşük antibiyotik konsantrasyonu MİK değeri olarak değerlendirilmiştir[1]. Penisilin için MBK'yi belirlemek amacıyla bulanıklık gözlenmeyen kuyucuklara 2000 U/mL'lik penisilinaz enziminden 10 µL konmuş, kuyucuklardaki süspansiyon iyice karıştırıldıktan sonra 10 µL alınarak %5 koyun kanlı agara pasaj yapılmıştır. Penisilinaz enzimi eklenerek sıvı besiyerinden, katı besiyerine antibiyotik taşınması önlenmiştir[14]. 37°C'de 30-48 saatlik inkübasyondan sonra üreme gözlenmeyen veya en fazla 1-2 koloni görülen en düşük sulandırım MBK olarak değerlendirilmiştir[10,12].
BULGULAR
Bir çok araştırmacı penisilin toleransının belirlenmesinde taze örneklerin kullanılmasını önermekte ve stok kültürde toleransı saptama olasılığının düştüğünü vurgulamaktadır[13]. Biz de bu nedenle 50 stok kültür ve 51 taze kültür örneklerini çalışmamız kapsamına aldık. Ancak aralarında anlamlı bir fark saptayamadık (p > 0.5, istatistiksel değerlendirme ki kare testine göre yapılmıştır).
Çalışmaya alınan 101 AGBHS kökenlerinin hepsi in vitro penisilin G'ye duyarlı bulunmuş ve MİK aralıkları Tablo 1'de görüldüğü gibi 0.5- 0.0039 µg/mL, MBK aralıkları ise 4-0.0039 µg/mL olarak saptanmıştır. Kökenlerin MBK/MİK oranları Tablo 2'de gösterildiği gibi bir köken dışında 1-16 arasında saptanmıştır. Bir köken için ise Tablo 3'te görüldüğü gibi MİK'in 2 katı antibiyotik konsantrasyonunda bakterisid etki gösterdiği halde,128 kat konsantrasyonda suşun önemli oranda canlı kaldığı, bu kökenin toleran olduğu ve Eagle fenomeni gösterdiği kabul edilmiştir.
Çalışmamızda, AGBHS olduğu saptanan 101 kökenin 96'sı eritromisine duyarlı, 5 köken eritromisine dirençli bulunmuştur. Kökenlerin MİK değerleri Tablo 4'te gösterilmiştir.
TARTIŞMA
Tolerans olayında, bakteriler antibiyotiğin yalnızca öldürücü etkisinden korunabilmektedir. Bir bakterinin bir antibiyotiğe toleran olması ile duyarlı veya dirençli olması arasında bir ilişki yoktur. Yapılan çeşitli çalışmalarda tolerans oranları oldukça farklı bulunmuştur. Bu oranların farklı olmasının nedeni henüz tolerans belirlemede kullanılan standart bir yöntemin bulunmamasıdır. Çeşitli etkenler MİK ve MBK değerlerini etkilemektedir. Bunlar arasında stok veya taze izolatlarla çalışmak, bakterinin üreme fazı, inokülum miktarı, subkültür için alınan koloni sayısı, makrodilüsyon veya mikrodilüsyon yöntemi, kullanılan besiyerinin özellikleri, inkübasyon süresi, sıvı besiyerinden subkültür için alınan miktar, MBK'yi belirlemek için sıvı dilüsyonlardan katı besiyerine ekim yapma sırasında antibiyotiğin taşınması, toleransı saptamada kullanılan MBK/MİK oranı gibi faktörler sayılabilir. Standart yöntemin belirlenmesi ile bu sorun ortadan kalkarak güvenilir sonuçlar alınabilir[6,10,12]. Biz de çalışmamızda stok ve taze kültür örneklerini karşılaştırmalı çalışarak, tolerans saptamada önemini araştırdık. Aralarında anlamlı bir fark saptayamadık. Ancak örnek sayısını arttırarak anlamlı değerlendirme yapılabileceğini düşünmekteyiz.
Graham ve arkadaşları, MBK/MİK ≥ 16 kabul ederek, klinik olarak iyileşmeyen 18 hastadan izole ettikleri 18 kökenin 11'inin penisiline toleran olduğunu, tedavisi başarılı olanlardan izole edilenlerde ise tolerans görülmediğini bildirmişlerdir[5]. Dagan ve arkadaşları toplu halde yaşayan 42 çocuk arasında bir streptokok farenjit epidemisinde, tüm kökenlerde tolerans saptamıştır[1]. Kim ve arkadaşları aynı şekilde klinik iyileşme göstermeyen hastaların %25'inde tolerans saptadıklarını bildirmişlerdir[15]. Belirtilen bu sonuçların aksine bazı araştırmacılar tolerans ve tedavi başarısızlığı arasında bir ilgi olmadığını söylemişlerdir. Smith ve arkadaşları penisilin tedavisindeki başarı veya başarısızlığın sadece toleransa bağlı olmadığını ve bir çok faktörün etkili olduğunu savunmuşlardır[3]. Brook ise orofaringeal florada bulunan aerob ve anaerob bakterilerin ürettiği beta-laktamazın penisilini inaktive ederek tedavide başarısızlığa yol açtığını belirtmiştir[4]. Feldman ve arkadaşları penisilinle tedavi edilemeyen %12 akut farenjitli hastada penisilin toleransına rastlanmadığını bildirmişlerdir[2].
Çalışmamızda kökenlerin hepsi penisilin G'ye duyarlı bulunmuştur. Yüz AGBHS kökeninde tolerans saptanamamış ancak bir kökene MİK'in 2 katı antibiyotik konsantrasyonda bakterisid etki gösterdiği halde, bu kökenin 128 kat konsantrasyonda önemli oranda canlı kaldığı, Eagle fenomeni gösterip toleran olduğu kabul edilebilir. 1948 yılında Eagle; bakterisid olan penisilinin, MİK'in hemen üstündeki konsantrasyonlarda bakterinin ölümüne yol açtığı halde, çok daha yüksek konsantrasyonlarda bakteri ölümünün azaldığını yani etkinin bakteriyostatik hale döndüğünü göstermiştir[16]. Ülkemizde de Gürler ve arkadaşları, 70 AGBHS kökeninden birinin Eagle fenomeni gösterdiğini ve toleran kabul edildiğini bildirmişlerdir[14]. Dündar ve arkadaşları %2.2, Babacan ve arkadaşları %3, Ergüven ve arkadaşları %8 oranında tolerans belirlerken, Karabiber ve arkadaşları, Kaloğlu ve arkadaşları tolerans saptayamamışlardır[17-21].
Sağlıklı bilgilere ulaşmak için toleransın in vitro belirleme yöntemlerinin belirli standardizasyonuna gereksinim vardır. Ayrıca in vitro ve in vivo durum birlikte değerlendirilerek, toleran ve toleran olmayan kökenlerin, tedavideki durumlarının incelenmesinin daha yararlı olacağını düşünmekteyiz. Gerek tonsillofarenjit epidemilerinin ortaya çıktığı toplumlarda, gerekse menenjit, endokardit, osteomiyelit gibi infeksiyonlarda tedavi başarısızlığı izlenen hastalarda ve bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda toleransın araştırılması önerilmektedir[8].
Eritromisin penisilin toleransı gelişen AGBHS infeksiyonlarının tedavisinde son derece etkilidir. Ancak yaygın kullanımı direnç gelişmesine neden olmaktadır[9]. Direncin yıllara göre artışı ve coğrafi farklılık nedeniyle eritromisin direncinin araştırıldığı çalışmaların sonuçları da değişiktir. Genel olarak eritromisin %4-22 oranında değişmektedir. Witler ve arkadaşları, Hawai'de asker toplumda %4, sivil toplumda %6, Filipinlerde %0, Japonya'da %61.8, ABD'de %2-4 olduğunu bildirmişlerdir[22]. 1984 yılında Trallero ve arkadaşları %0.7, 1988 yılında Phillips ve arkadaşları ise %22.8 olduğunu bildirmişlerdir[23,24]. Direnç artışı üst solunum yolu infeksiyonlarında yaygın olarak eritromisin kullanımına bağlanmıştır[25]. Ülkemizde yapılan çalışmalarda ise AGBHS'lerde eritromisin direnci %2.5-9.7 arasında bildirilmektedir. Bu çalışmalarda eritromisin direncini; Ergüven ve arkadaşları 1990 yılında %2.5, Türet ve arkadaşları 1990 yılında %4.2, Durmaz ve arkadaşları 1992 yılında %5, Gürsoy ve arkadaşları 1994 yılında %7, Yavuzdemir ve arkadaşları 1997 yılında %9.7, Kaloğlu ve arkadaşları 1997 yılında %4 olarak bildirmişlerdir[19,21,26-29]. Bizim çalışmamızda eritromisin direnci %5 olarak bulunmuştur.
AGBHS'lerde az da olsa eritromisin direncinin görülmesi, direncin giderek artması ve direncin kökenler arasında aktarılabileceği olasılığı uygun antibiyotik kullanımının önemini ortaya koymaktadır. Eritromisin ile tedavinin başarısız olduğu durumlarda, eritromisin direnci düşünülmelidir. Rutin olarak test edilmesi önerilmemekle birlikte, penisilin allerjisi olan hastalarda eritromisin direnci araştırılmalıdır.
KAYNAKLAR
Yazışma Adresi:
Dr. Engin KARAKEÇE
Haydarpaşa Numune Hastanesi
Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarı
Haydarpaşa - İSTANBUL
Makalenin Geliş Tarihi: 29.06.1999 Kabul Tarihi: 27.11.1999